糖皮質(zhì)激素類藥殘留分析技術(shù)測定方法——免疫分析法

時間：2023-03-25 02:57:52來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

糖皮質(zhì)激素類藥殘留分析技術(shù)測定方法——免疫分析法

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(5)免疫分析法(immunoassay，IA)

1)放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)

RIA將放射性的靈敏度與免疫的特異度融合于一體，既簡便準(zhǔn)確，又靈敏可靠。Blahova等報道了采用RIA測定血清、血漿和尿液中的氫化可的松的方法。采用RIA試劑盒直接檢測樣品中氫化可的松的含量，無需提取，而尿液樣品既可以直接檢測也可以提取后檢測。樣品與包被有氫化可的松示蹤劑(125I標(biāo)記)的單克隆抗體孵育1h，水平400r/min振蕩1h，多通道γ計數(shù)器檢測，標(biāo)準(zhǔn)曲線計算氫化可的松的濃度。該RIA方法的線性范圍為3.64～725ng/mL，LOQ為3.64ng/mL，CV為0.27%～13.%。采用HPLC和該RIA方法對66份鯉魚樣品進(jìn)行分析，相關(guān)性為HPLC=0.9454RIA+0.40676，相關(guān)系數(shù)為0.815。

2)酶聯(lián)免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)

ELISA是采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，并將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定，靈敏度高，操作安全，不需要昂貴的儀器，可以滿足大批量快速篩選的需求。

Roberts等報道了采用ELISA方法檢測馬尿中的地塞米松。藥物-蛋白結(jié)合物被固定在微孔板上，抗體與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品和藥物-蛋白結(jié)合物競爭?？贵w與固定在微孔板上的藥物-蛋白結(jié)合物結(jié)合的比例可以被原位測定，而達(dá)到定量目的。該方法在0.75ng/mL、1.5ng/mL、5.0ng/mL三個添加濃度回收率為102.0%～141.7%。與RIA法比較，并經(jīng)GC-MS驗證，該ELISA方法不僅快捷、方便，而且準(zhǔn)確率高。胡擁明等分別以地塞米松、倍他米松、雙氟米松為半抗原制備抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地塞米松抗體的群選性最強(qiáng)，對雙氟米松、倍他米松、曲安西龍和潑尼松龍的交叉反應(yīng)率分別為120%、73%、37%和21%，對其他3種內(nèi)源性類GCs交叉反應(yīng)率均小于0.1%。由此建立了間接競爭ELISA方法檢測雞肌肉組織中的GCs。1g組織樣本，加入3mL的蒸餾水，渦旋混合1min，加入4mL的乙酸乙酯，搖動樣本30min，4℃下2000r/min離心10min，吸取1mL的上清液于玻璃試管中，50℃時在適當(dāng)?shù)牡獨饬飨逻M(jìn)行揮發(fā)T燥，將殘渣溶解于0.5mL 10%甲醇的PBS溶液，ELISA檢測。該方法的回收率為61.3%～80.3%，CV小于15%，地塞米松、倍他米松、雙氟米松的LOD分別為0.14ng/mL、0.56ng/mL和0.21ng/mL。同時，將ELISA方法與LC-MS法對比，相關(guān)系數(shù)為0.9981，表明兩者具有很高的相關(guān)性。Kolanovic等建立了可以在歐盟MRL或要求檢出水平(RPL)下快速、靈敏地定性篩查測定牛奶與尿液中地塞米松、倍他米松、氟米松和潑尼松龍，以及肝臟樣品中地塞米松、氟米松和潑尼松龍的ELISA方法。依據(jù)歐盟2002/657/EC標(biāo)準(zhǔn)，通過測定CCβ、特異性、LOD、LOQ、回收率、實驗室內(nèi)重現(xiàn)性、線性和耐用性等對建立的定性篩查方法進(jìn)行確認(rèn)。牛奶、尿及肝臟樣本的LOD分別為0.2μg/kg、1.2μg/kg和0.6μg/kg，LOQ分別為0.3μg/kg、1.2μg/kg和1.4μg/kg。地塞米松、氟米松、β-米松和潑尼松龍的添加回收率分別為68%～131%、57%～120%、60%～155%、23%～32%，CV在1.6%～21.2%之間。所有被測基質(zhì)中CCβ低于MRL/RPL。通過適度改變肝臟和牛奶樣品前處理中一些關(guān)鍵因素對可靠性進(jìn)行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未對GCs檢測造成任何不良影響。

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