蜂王漿及凍干粉中9種硝基咪唑類藥物殘留量測(cè)定分析條件的選擇

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

16.2.3.7 分析條件的選擇

(1)色譜分離條件研究

1)色譜柱的選擇

本方法選擇了Waters公司的Sunfire-dC18柱(φ4.6 mm×250 mm； 5 um)和資生堂公司的UG120(φ4.6mm×250mm；5um)和MG-II C18柱(中4.6 mm×250 mm； 5 um)等色譜柱進(jìn)行了比較。前者Sunfire-dC18柱對(duì)于多數(shù)堿性化合物保留都比較合適，pH適用范圍廣，在相同的流動(dòng)相設(shè)置條件下，Waters Sunfire-dC18柱(φ4.6 mm× 250 mm； 5 um)的保留時(shí)間、響應(yīng)峰的尖銳程度(信噪比S/N)以及分離度相對(duì)更優(yōu)異、適合。

2)流動(dòng)相的選擇與優(yōu)化

LC-MS/MS實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相一般是甲酸、乙酸水溶液以及乙酸銨(揮發(fā)性鹽)或者低濃度的乙酸銨鹽溶液、乙酸-乙酸銨離子對(duì)緩沖鹽(需要時(shí)調(diào)節(jié)pH)等。對(duì)于多數(shù)正離子模式下的分析，按照實(shí)驗(yàn)工作和儀器工程師經(jīng)驗(yàn)推薦，一般需要少量的酸[H]+離子，利于正離子化和[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰的生成電噴霧電離離子源(ESI和APCI)容易受到樣品基質(zhì)的影響。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，樣品基質(zhì)對(duì)離子化有比較大的抑制作用(氣相色譜和氣質(zhì)色譜多表現(xiàn)為增強(qiáng))，不同樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物離子化的抑制情況存在顯著差異。為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，以空白樣品提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，可以使標(biāo)準(zhǔn)和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而消除或者大大降低樣品基質(zhì)效應(yīng)的不一致影響。

(3)提取和凈化條件的選擇

本方法最后確定的提取過(guò)程中，稱取約2.5～5.0g蜂產(chǎn)品樣品(蜂王漿、蜂蜜稱量5.0g±0.2g；凍干粉稱量2.5g±0.2g)于50mL離心管中，分別添加氘代標(biāo)示物HMMNI-D3、IPZ-OH-D3(100ng/mL)100μL，加入20mL乙酸銨(0.1mol/L)溶液充分渦旋提取1min。再加入20mL乙酸乙酯，經(jīng)過(guò)渦旋、液液萃取，將乙酸乙酯層全部移入雞心旋蒸瓶，重復(fù)上述操作，合并三次乙酸乙酯提取液于雞心旋蒸瓶，在40℃以下濃縮近干，除去溶劑。

本方法最后確定的凈化過(guò)程中，雞心旋蒸瓶殘?jiān)?mL四氯化碳和1mL甲酸水溶液(0.1%)溶解，充分渦旋1min。吸取上層水溶液，用微孔過(guò)濾膜(0.2μm)過(guò)濾，此為試驗(yàn)溶液。

(4)前處理選擇和討論

蜂王漿樣品含有大量蛋白質(zhì)的均勻膠體，要從蜂王漿中提取抗生素和目標(biāo)化合物，必須破壞其膠體狀態(tài)。文獻(xiàn)中有的選擇2%三氯乙酸和2%檸檬酸沉淀蛋白，經(jīng)實(shí)驗(yàn)，沉淀蛋白質(zhì)時(shí)間短，效果理想，但是沉淀后的上清液經(jīng)乙酸乙酯提取后，由于有酸性溶液存在，乙酸乙酯溶液難濃縮干。還有的實(shí)驗(yàn)而在負(fù)離子電離模式下，低濃度的乙酸銨鹽溶液能夠起到參與增強(qiáng)和活化離子化過(guò)程作用(比如氯霉素的LC-MS/MS方法下的流動(dòng)相為2mmol/L的乙酸銨和乙腈混合梯度)。當(dāng)然，如果梯度選擇不當(dāng)或者不優(yōu)化，造成峰形不是很好，峰尖不夠尖銳，甚至保留時(shí)間有較大漂移，原因不詳。采用0.1%的甲酸溶液作為流動(dòng)相，峰形優(yōu)異，響應(yīng)較好，也非常穩(wěn)定。

(2)質(zhì)譜測(cè)定條件的研究

1)質(zhì)譜測(cè)定條件的優(yōu)化

首先采用1mg/L的目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別以流動(dòng)注射的方式在正/負(fù)離子模式下分別進(jìn)行ESI源或者APCI源的母離子全掃描。

大氣壓電離源(atmospheric pressure chemical ionisation，APCI)是由ESI(電噴霧電離源)派生出，用大氣壓下電暈放電產(chǎn)生反應(yīng)離子，既而再與溶液中樣品分子發(fā)生離子分子反應(yīng)，從而產(chǎn)生樣品的質(zhì)子化分子([M+H]+)或加合離子。APCI在小分子分析中與ESI相比，是一種溫和的電離方式；目前，國(guó)內(nèi)雖然大部分LC質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室配備了APCI，但是實(shí)際使用和開(kāi)展的應(yīng)用非常少。本次實(shí)驗(yàn)中，首先嘗試使用ESI源摸索質(zhì)譜條件，效果并不理想：總離子流較低，Q1全掃描特征母離子響應(yīng)不明顯；通過(guò)改變方式，將連續(xù)推注針閥PEEK管端與HPLC接色譜柱的PEEK管端以三通的連接方式共同導(dǎo)入所使用的APCI源LC入口，進(jìn)行質(zhì)譜條件實(shí)驗(yàn)：設(shè)定HPLC四元泵以200μL/min左右且適合硝基咪唑化合物液相等度分離的流動(dòng)相比例運(yùn)行，同時(shí)，配吸有Nitroimidazoles各主要分析物單標(biāo)(濃度5～10ppm左右均可)的連續(xù)推注針閥仍按常規(guī)方式以5uL/min的速度工作。由于解決了單標(biāo)藥物溶液的持續(xù)供給(ESI方式不存在這個(gè)矛盾)，并通過(guò)提供適量且連續(xù)流動(dòng)液，再輔助以150℃左右的霧化加熱，使得APCI電離方式得到極至發(fā)揮。

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)確定：在APCI源正離子模式下硝基咪唑類的準(zhǔn)分子離子峰響應(yīng)信號(hào)更優(yōu)越；以硝基咪唑類正離子模式下的準(zhǔn)分子離子為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，初步選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的兩至三對(duì)子離子為定性離子。

2)樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除

電噴霧電離離子源(ESI和APCI)容易受到樣品基質(zhì)的影響。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，樣品基質(zhì)對(duì)離子化有比較大的抑制作用(氣相色譜和氣質(zhì)色譜多表現(xiàn)為增強(qiáng))，不同樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物離子化的抑制情況存在顯著差異。為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，以空白樣品提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，可以使標(biāo)準(zhǔn)和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而消除或者大大降低樣品基質(zhì)效應(yīng)的不一致影響。

(3)提取和凈化條件的選擇

本方法最后確定的提取過(guò)程中，稱取約2.5～5.0g蜂產(chǎn)品樣品(蜂王漿、蜂蜜稱量5.0g±0.2g；凍干粉稱量2.5g±0.2g)于50mL離心管中，分別添加氘代標(biāo)示物HMMNI-D3、IPZ-OH-D3(100ng/mL)100μL，加入20mL乙酸銨(0.1mol/L)溶液充分渦旋提取1min。再加入20mL乙酸乙酯，經(jīng)過(guò)渦旋、液液萃取，將乙酸乙酯層全部移入雞心旋蒸瓶，重復(fù)上述操作，合并三次乙酸乙酯提取液于雞心旋蒸瓶，在40℃以下濃縮近干，除去溶劑。

本方法最后確定的凈化過(guò)程中，雞心旋蒸瓶殘?jiān)?mL四氯化碳和1mL甲酸水溶液(0.1%)溶解，充分渦旋1min。吸取上層水溶液，用微孔過(guò)濾膜(0.2μm)過(guò)濾，此為試驗(yàn)溶液。

(4)前處理選擇和討論

蜂王漿樣品含有大量蛋白質(zhì)的均勻膠體，要從蜂王漿中提取抗生素和目標(biāo)化合物，必須破壞其膠體狀態(tài)。文獻(xiàn)中有的選擇2%三氯乙酸和2%檸檬酸沉淀蛋白，經(jīng)實(shí)驗(yàn)，沉淀蛋白質(zhì)時(shí)間短，效果理想，但是沉淀后的上清液經(jīng)乙酸乙酯提取后，由于有酸性溶液存在，乙酸乙酯溶液難濃縮干。還有的實(shí)驗(yàn)采用文獻(xiàn)方法，選10%偏磷酸溶液沉淀蛋白質(zhì)，但是這些處理手段效果都一般。

本實(shí)驗(yàn)前期的工作主要采用稱取約5.0～10g±0.2g左右的蜂產(chǎn)品樣品(包括蜂王漿、蜂蜜、凍干粉等)于250mL錐形瓶中，依次加入多種硝基咪唑類藥物、氘代標(biāo)示物HMMNI-D3、IPZ-OH-D3后，分別加入18mL、5～10mL、10mL的2mol/L氫氧化鈉溶液、20mmol/L乙酸銨溶液、2mol/L鹽酸溶液。

其中氫氧化鈉溶液和乙酸銨溶液加入后需要及時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行渦旋、溶解，樣品進(jìn)一步均勻化后用2mol/L鹽酸進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。

隨后將充分渦旋的樣品均勻的平分到兩個(gè)50mL的塑料離心管中，分別加入15mL乙腈、15mL乙酸乙酯。對(duì)樣品進(jìn)行渦旋、液液萃取。

每個(gè)獨(dú)立樣品需要收集平分到兩個(gè)50mL的塑料離心管中的有機(jī)相提取液，旋渦混合儀充分混勻2min，放入高速冷凍離心機(jī)離心(時(shí)間10min，轉(zhuǎn)速5000r/min)；吸取有機(jī)層；合并到一個(gè)雞心旋蒸瓶中；并分別再次加入5mL乙腈、5mL乙酸乙酯；對(duì)樣品進(jìn)行渦旋、液液萃取后合并提取液。合并后的提取液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮近干(可能會(huì)有2～4mL水相)，再次加入0.2mol/L的鹽酸溶液15mL，充分混勻，備用供SPE柱凈化。

用OASIS MCX C18 SPE柱凈化(先用5mL水、5mL甲醇活化，上樣后分別10mL水、10mL甲醇淋洗)，經(jīng)10%氨水甲醇溶液5mL洗脫，收集至15mL離心管中，于氮吹儀氮吹揮至近干，加入1mL流動(dòng)相，充分旋渦混合，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，供HPLC-MS/MS分析。

這一處理過(guò)程結(jié)果相對(duì)較為復(fù)雜繁瑣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中替硝噠唑和洛硝唑回收率不理想，所以最后選擇了加入20mL的0.1mol/L乙酸銨、乙酸乙酯，液液萃取，濃縮近干，除去溶劑后殘?jiān)?mL四氯化碳和1mL甲酸水溶液(0.1%)溶解，充分渦旋1min，吸取上層水溶液進(jìn)樣的方案。

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