硝基呋喃類代謝物最大允許殘留分析技術——測定方法（二）

時間：2023-03-25 05:40:31來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

硝基呋喃類代謝物最大允許殘留分析技術——測定方法（二）

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

(3)液相色譜-質譜聯用法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)

LC-MS串聯技術擁有高效的分離能力，出色的檢測靈敏度和較強的克服雜質干擾能力，是目前測定NFs代謝物最主要的技術手段，而LC-MS/MS則是最常用的方法。

1)液相色譜-單級質譜法(LC-MS)

LC-MS是將單四極桿質譜儀作為一種檢測器與LC連接，是LC-MS儀的早期產品。與LC-MS/MS相比，在靈敏度和選擇性上都要相差不少，主要用在NFs及其代謝物檢測技術的早期開發上。

1996年Horne等開發了AOZ和AMOZ的LC-MS檢測方法。用鄰硝基苯甲醛衍生，經LLP后，用LC-MS測定，肝臟樣品的檢測限為10μg/kg。朱堅建立了雞肉和蝦中AOZ和AMOZ殘留量的LC-MS測定方法。樣品用酸水解，鄰氯苯甲醛衍生化，經SPE柱凈化后，用LC-MS檢測。在電噴霧電離(ESI)正離子、選擇離子監測(SIM)模式下，方法檢測低限為0.3×10-9數量級。林黎明等建立了雞組織及蛋中4種NFs代謝產物的LC-MS方法。用AMOZ-d5，AOZ-d4作內標，經ENSPE柱凈化，以乙腈-0.1%甲酸為流動相，采用梯度洗脫，可在15min內將4種代謝產物完全分離并進行測定。方法回收率為85%～90%，檢出限可達0.5μg/kg。徐維海等采用LC-MS方法研究呋喃唑酮及其代謝產物AOZ在羅非魚體內的殘留規律。在大氣壓化學電離源(APCI)電離模式下，呋喃唑酮及其代謝物AOZ的檢出限分別為10μg/kg和1μg/kg。

2)液相色譜-質譜/質譜法(LC-MS/MS)

由于出色的靈敏度、選擇性，而且還能夠提供禁用藥物確證所需的結構信息，LC-MS/MS已成為NFs代謝物檢測最常用的方法，也是大多數國家和組織認可的方法。

A.組織樣品分析

Alexander等首次報道用LC-MS/MS同時分析動物肌肉組織中4種NFs代謝物的方法。分析物被酸性水解，后從組織中釋放，用2-硝基苯甲醛衍生化，利用SPE凈化樣品，LC-MS/MS在ESI正離子、MRM模式下檢測。4種NFs代謝物AOZ、AMOZ、SEM、AHD的LOD分別為0.5ng/g、0.5ng/g、3.0ng/g、5.0ng/g，LOQ分別為2.5ng/g、2.5ng/g、10.0ng/g、10.0ng/g，測定響應值的線性范圍從檢測限到800ng/g之間。彭濤等也率先在國內報道了用LC-MS/MS測定動物組織中NFs代謝物的方法。鹽酸水解組織中蛋白結合代謝物，同時加入2-硝基苯甲醛，37℃過夜衍生。上清液調pH7.0后，用OasisHLB柱凈化。采用ESI電離，正離子，選擇反應監測(SRM)模式檢測。三離子原則，外標法定量。LOQ為AMOZ、AOZ 0.1ng/g，SEM、AHD 0.5ng/g；LOD為AMOZ、AOZ 0.05ng/g，SEM、AHD 0.1ng/g，低于歐盟規定的1μg/kg的方法靈敏度要求。在添加濃度0.5～10ng/g范圍內，AMOZ回收率為65.4%～91.3%，SEM回收率為62.7%～94.6%，AHD回收率為63.9%～89.4%，AOZ回收率為67.8%～90.9%，RSD均小于4.8%。龐國芳等建立了用LC-MS/MS測定禽肉組織中AOZ、AMOZ、SEM和AHD4種NFs代謝物的方法。0.2mol/L鹽酸水解禽肉組織中與蛋白結合的NFs代謝物，用2-硝基苯甲醛37℃衍生16h。上清液調pH7.4后，用LiChrolutEN柱凈化，乙酸乙酯洗脫，流動相定容。采用ESI電離，正離子掃描，MRM模式檢測。標準曲線用空白禽肉樣品添加標準與樣品同步操作獲得，并用其進行外標定量。在添加濃度0.5～10μg/kg范圍內，4種代謝物的平均回收率在70.2%～89.1%之間；LOD為AMOZ、AOZ0.1 μg/kg，SEM、AHD0.2μg/kg；4種代謝物LOQ均為0.5μg/kg；10次測定結果RSD在5.59%～10.10%之間。Verdon等采用LC-MS/MS方法，測定了火雞肌肉中的5種NFs(呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、硝呋柳肼)的代謝產物SEM、AOZ、AMOZ、AHD、DNSAH。將水解、衍生的過程從37℃ 16h縮短至55℃ 4h，結果表明對測定并無顯著影響。采用乙酸乙酯提取，內標法定量，由于DNSAH暫無同位素內標，采用由另一化合物硝呋酚酰肼得到的水楊酸肼作為內標校正。該方法同樣適用于其他家禽肌肉、蜂蜜、雞蛋和豬組織，LOQ均低于0.5μg/kg。Bock等驗證了檢測雞肉和蝦肉中的4種NFs代謝物的確證方法，并進行了不確定度評價。方法用穩定同位素標記的代謝物進行內標法定量，不同的樣品基質以及樣品狀態(新鮮或者凍干樣品)均會導致內標的回收率發生變化，從而影響方法的準確度，因此需要同時應用內標和基質標準曲線才能實現準確定量。在穩定性試驗中，樣品可以在-25℃下保存12個月。方法的CCa為0.1～0.7μg/kg，CCβ為0.1～0.9μg/kg，CV在7%～17%之間。趙善倉等開發了畜產品中4種NFs代謝物殘留的超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)快速檢測方法。樣品經衍生化后，用乙酸乙酯提取，正己烷凈化，流動相定容。采用ESI電離，正離子掃描，MRM方式采集數據，外標法定量。在添加濃度為0.1～2.0ug/kg范圍內，4種代謝物的平均回收率在67.3%～85.0%之間，10次測定結果的CV在2.0%～9.7%之間；最低檢出限均達到0.15μg/kg；在0.1～20.0ng/mL的線性范圍內，相關系數r均大于0.99。實現了樣品檢測的快速和高靈敏，適用于豬肉和豬肝中NFs代謝物的殘留檢測。劉紅衛等采用UPLC-MS/MS，ESI電離，正離子模式，對腸衣中4種NFs代謝物殘留量進行定性定量檢測。用甲醇、水脫脂去除部分雜質，經OasisHLB小柱富集凈化后，用Waters ACQUITY UPLC TM BEH C18色譜柱分離，以0.3%乙酸乙腈溶液和0.3%乙酸溶液為流動相，梯度洗脫。在MRM模式下以保留時間和離子對(母離子和兩個子離子)信息比較進行定性，以響應值高的子離子進行定量。該法的檢出限為0.2～0.5μg/kg，加標回收率為86%～97%，RSD小于10%。

B.蜂產品分析

丁濤等報道了LC-MS/MS測定蜂王漿中呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮4種NFs代謝物殘留的方法。以三氯乙酸作為蜂王漿的蛋白質沉淀劑，同時提供衍生化反應所需的酸性環境；使用4種同位素內標，補償了衍生化效率、衍生后樣品溶液的pH及光照對定量結果所產生的影響，極大地提高了定量的準確性。實驗結果表明，呋喃它酮代謝物的LOD可以達到0.03μg/kg，其他3種代謝物可以達到0.05μg/kg(S/N大于5)；呋喃它酮代謝物的LOQ可以達到0.20μg/kg，其他3種代謝物可以達到0.25μg/kg(S/N大于10)；線性范圍為0.4～20ng/mL，添加回收率為97.7%～104.8%(內標校正)，RSD為2.7%～9.7%。Khong等建立了檢測蜂蜜中NFs代謝物的同位素稀釋LC-MS/MS方法。HPLC分析柱為反相C18柱(150mm×2.1mm，3.5μm)，流動相為水(含0.025%的乙酸)和乙腈，采取線性梯度洗脫的方式，流速為0.3mL/min，分析物在正離子模式進行分析，ESI源，源溫為300℃，毛細管電壓為5.5kV，掃描模式為MRM。氘代化的NFs代謝物隨樣品一起衍生化，以內標法進行準確定量。NFs的檢測靈敏度達到1.0μg/kg，在此濃度進行添加回收實驗，回收率為82%～112%。AHD、AMOZ、AOZ、SEM的CCa分別為0.46μg/kg、0.07μg/kg、0.12μg/kg、0.36ug/kg，CCβ分別為0.56μg/kg、0.12μg/kg、0.18μg/kg、0.43μg/kg。在篩查市場上蜂蜜的用藥情況時，100多個蜂蜜樣品中的14%含有AOZ，21%含有SEM。余建新等采用微量化樣品前處理技術，以鄰硝基苯甲醛為衍生劑，ESI正離子、MRM方式建立了蜂蜜中4種NFs代謝物殘留量同時測定的LC-MS/MS方法。方法的檢出限為0.02～0.3ng/g，線性范圍均大于102，線性方程的相關系數r大于0.997，回收率為79.0%～95.6%。

C.乳、蛋分析

彭濤等用LC-MS/MS法同時測定奶粉中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代謝物。鹽酸水解奶粉中蛋白結合的代謝物，同時加入2-硝基苯甲醛，37℃過夜衍生化。加入硫酸鋅，調pH7.0后，再加入亞鐵氰化鉀去除蛋白。然后用乙酸乙酯提取，正已烷凈化，分析物采用ESI正離子、MRM模式檢測，內標法定量。在添加濃度0.5～2μg/kg范圍內，內標法回收率為89.5%～110.3%；RSD小于11.3%。AMOZ、AOZ的LOD為0.05μg/kg，SEM、AHD為0.1μg/kg。Chu等應用LC-MS/MS方法檢測了牛奶中的NFs代謝物的殘留量。液相色譜的流動相為甲醇和20mmol/L乙酸銨，串聯質譜在APCI正離子模式下，應用MRM進行采集數據。每個監測離子對的駐留時間為150ms，離子源溫度為350℃，離子噴霧電壓為5.5kV。此方法中4種藥物的回收率為83%～104%，CV均小于13%；AOZ、SEM、AHD和AMOZ的LOD分別為0.1ng/g、0.2ng/g、0.2ng/g、0.1ng/g，LOQ為0.2ng/g。

曹文卿等建立了蛋黃粉中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮等NFs代謝物殘留的LC-MS/MS測定方法。利用硅藻土為基質分散劑對蛋黃粉進行基質分散，三氯乙酸溶液沉淀蛋白并提供水解環境，2-硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯液液萃取等前處理手段對蛋黃粉中的硝基呋喃代謝產物進行了提取和凈化，LC-MS/MS檢測。方法測定低限為0.5μg/kg，線性范圍為0.5～6.0μg/kg，室內驗證回收率范圍為90.06%～109.8%，RSD為2.0%～7.7%。Bock等建立了雞蛋中NFs代謝物的LC-MS/MS方法，并進行了驗證。AHD和SEM的CCa和CCβ均在0.2μg/kg左右，AMOZ的CCa和CCβ在0.05μg/kg左右，AOZ的CCa和CCβ低于0.05μg/kg。

D.血漿、血清分析

Radovnikovic等建立了UHPLC-MS/MS方法用于動物血漿中(牛、羊、馬和豬)的4種NFs代謝物(AHD、AOZ、SEM、AMOZ)的確證檢測。血漿樣品用2-硝基苯甲醛衍生化，隨后用有機溶劑萃取，萃取液濃縮，然后通過UHPLC-MS/MS分析。該方法根據歐盟委員會決議2002/657/EC進行了驗證。AHD、AOZ、SEM和AMOZ的回收率分別為72%、74%、57%和71%；CCa分別為0.070μg/kg、0.059μg/kg、0.071μg/kg和0.054μg/kg。這種方法可作為農場獸藥監控制的替代方法。Tai等應用LC-MS/MS測定了畜牧場及肉品市場豬血清中4種NFs藥物代謝物殘留。樣品通過水解蛋白質鍵合的藥物代謝物，并與2-硝基苯甲醛衍生化，通過乙酸乙酯LLP進行凈化，然后將乙酸乙酯層用氮氣流蒸發至干，將殘余物重新溶解于50%甲醇溶液，0.22um過濾器過濾后，采用ZORBAX eclipse XDB-C18柱分離，ESI正離子模式電離，在MRM模式下進行LC-MS/MS分析。方法LOQ為0.2ppb；SEM、AOZ、AHD和AMOZ的回收率分別為75.0%～97.6%、90.0%～92.6%、92.0%～84.4%和94.0%～94.2%，其標準偏差分別為0.06、0.04、0.06和0.05；對950個樣品進行了檢測，其中2例樣品中AOZ和AH和呈陽性，其測定的濃度范圍為2.5～19.4ppb。

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