大環內酯類和林可胺類藥物殘留測定方法——微生物法和氣相色譜法

時間：2023-03-25 05:45:48來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

大環內酯類和林可胺類藥物殘留測定方法——微生物法和氣相色譜法

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

6.1.4.2 測定方法

MALs種類較多，結構相似，對于該類藥物的安全使用和殘留檢測一直是各國關注的焦點和研究的重點。而林可胺類藥物常常與MALs同時使用，因此需要進行多殘留同時分析。目前，國內外關于MALs和林可胺類藥物殘留分析的文獻較多，其檢測方法主要包括微生物法、免疫分析法(IA)、薄層色譜法(TLC)、毛細管電泳法(CE)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣質聯用法(GC-MS)和液質聯用法(LC-MS)等。總體說來，大多儀器分析技術基本都可用于兩類藥物的殘留檢測，以HPLC和LC-MS最為常見。隨著殘留分析技術的發展，CE和TLC由于靈敏度達不到要求而逐漸被色質聯用法所代替。

(1)微生物法(microbiologicalanalysis)

微生物法是經典的MALs含量測定方法。王敏等利用微生物生長抑制的原理，對6種MALs殘留進行了定性檢測。該方法通過MALs敏感菌Bacillusstearothermophilus細菌的生長與否，來判斷MALs的存在。該方法對多種基質的動物源食品檢測限低，能夠達到食品中MALs的MRL的1/2，操作簡單且不需要復雜的儀器設備，可作為有效的篩選方法。Nouws等建立了微生物法測定牛奶中MALs等多種類藥物的殘留量。該方法以枯草桿菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌等作為試驗用菌株，通過平板上抑制區域的大小來判斷藥物殘留量的多少，除了少數幾種藥物，大多數待測抗生素的靈敏度都能滿足歐盟所規定的牛奶中抗生素MRLs的要求，待測的48種抗生素均未超過歐盟所規定的MPLs。在規定MRLs水平上，7種培養板的平均CV為4.5%～9.8%。黃曉蓉等利用微生物抑制法檢測了肉類、水產品及蛋中的MALs殘留量，方法的LOD值為0.05mg/kg。采用藤黃微球菌ATCC9341、枯草芽胞桿菌ATCC663、蠟樣芽孢桿菌蕈狀變種ATCCI1778為敏感菌，一次操作可同時檢測肉類、水產品及蛋中的四大類抗生素殘留。微生物法作為篩選方法具有簡便、快速、易操作等優點，但由于固有的局限性，結果可比性差，方法靈敏度不佳，達不到準確定性定量分析的目的，逐漸被儀器分析方法所取代。

(2)薄層色譜法(thinlayerchromatography，TLC)

TLC法用薄層板將樣品提取液中被測物展開分離后，測定樣品與標準樣品吸收光變化或采用發射光薄層掃描法來測定被測物含量。Ramirez等引采用了高效薄層色譜(HPTLC)-生物自顯影方法進行牛奶中紅霉素等藥物的多殘留檢測。該方法采用枯草桿菌作為檢測目標微生物，殘留的抗生素用乙腈進行提取，石油醚進行除脂后，用二氯甲烷進行分離。該方法完全滿足牛奶中殘留限量的要求，平均回收率達90%～100%，CV為7.2%～21.3%。這種高效薄層色譜分析大大地縮短了分析時間，并有效地改善了紅霉素等藥物的敏感性。韓南銀等建立TLC法來檢查蜂蜜中殘留的紅霉素。以固相萃取對紅霉素進行了提取，極性的硅膠作固定相，乙酸乙酯～乙醇-15%醋酸銨混合液(86+38+76，v/v)為展開劑，濃硫酸-香草醛-95%乙醇混合(4+0.33+36，v/v)作為顯色劑，其LOD可達5mg/kg。

(3)毛細管電泳法(capillaryelectrophoresis，CE)

作為分離技術中的一種，CE有較高的分離效率，可同時分析多種待測成分，且所需時間較少，并能準確定量。但是，也存在一些缺點，比如對于上樣量較少的樣品來說，往往靈敏度不夠。此種方法用于MALs和林可胺類藥物殘留分析的報道較少。李向麗等基于泰樂菌素能增強聯吡啶釕[Ru(bpy)32+]電化學發光信號的現象，結合CE分離技術，建立了動物組織和蜂蜜中泰樂菌素測定的新方法。實驗分別對檢測和分離條件進行了優化，在優化條件下，泰樂菌素在濃度0.05～10.00μg/mL范圍內具有良好的線性關系，LOD為0.02ug/mL，用于實際樣品中泰樂菌素的測定，回收率為80.0%～95.0%。

(4)氣相色譜法(gaschromatography，GC)

MALs和林可胺類藥物的分子量均較大，而且結構中含有較多的極性基團，直接采用GC分析是不行的，必須經過衍生化后才可以進行GC分析。

Luo等建立了鮭魚組織中林可霉素的GC檢測方法。采取磷酸緩沖液提取鮭魚組織中的林可霉素，經C18固相萃取凈化后，用N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺作衍生化試劑進行衍生，形成一個三甲基硅烷基，再進行GC分析，氮磷檢測器(nitrogen-phosphorusdetector，NPD)檢測。該方法在25～250ng/g濃度范圍內線性較好，相關系數r為0.994；在50ng/g、100ng/g、200ng/g三個添加濃度水平上，平均回收率均大于80%，RSD均小于6%；LOD為1.7ppb，LOQ為3.8ppb。陶燕飛等建立了動物可食性組織中林可霉素和大觀霉素殘留量的GC測定方法。提取物中加入500μL硅烷化試劑(BSTFA)和100μL乙腈，渦旋混合1min，密封，75℃恒溫箱中衍生化反應1h后，GC分離后NPD測定。該衍生化產物較為穩定，密封情況下至少一周不會降解，但應避免置于潮濕環境中。林可霉素的LOQ為30μg/kg，在30～3000ug/kg添加水平，回收率為73.2%～85.7%。該作者還應用GC-NPD和氣相色譜-質譜(GC-MS)建立了一種定性、定量測定動物性食品中林可霉素和大觀霉素殘留的多維分析方法。該方法采用磷酸鹽緩沖進行液加速溶劑萃取(ASE)，三氣乙酸脫蛋白，加入十二烷磺酸鈉作為離子對試劑進行C18固相萃取凈化，洗脫液吹干后用BSTFA衍生化，進行GC-NPD分析和GC-MS確認。這兩種藥物在GC-NPD方法中的LOQ分別為16.4μg/kg和21.4μg/kg，在GC-MS方法中的LOQ分別為4.1μg/kg和5.6μg/kg；添加水平為20～200μg/kg時，GC-NPD方法的回收率為73%～99%，RSD小于17%；添加水平為5～20μg/kg時，GC-MS方法的回收率為70%～93%，RSD小于21%。Takasuki等建立了組織中ERM、OLE、SPI、KIT、TYL的氣相色譜-質譜(GC-MS)分析方法。肉樣經甲醇提取、LLP后，再使用硅膠固相萃取柱凈化以除去干擾物質。提取物在鉑的催化下加氫，打開碳碳雙鍵結構，并在0.3mol/L鹽酸中水解脫去中性糖鏈，水解產物在醋酸酐-吡啶中酰化生成醋酸酯。衍生化的目的在于降低待測物的分子量和極性，而使用醋酸酐酰化較硅烷化得到的衍生物分子量更小，可提高質譜檢測的靈敏度。

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