β-受體激動劑殘留測定方法（三）

時間：2023-03-25 08:16:58來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

β-受體激動劑殘留測定方法（三）

[db:作者] / 2022-12-08 00:00

(7)色-質聯用分析法(chromatography-mass spectrometry analysis)

將色譜的高分離能力與質譜的定性能力結合起來，組成的聯用分析技術，不僅可以取長補短，起到方法間的協同作用，提高方法的靈敏度、準確度以及對復雜混合物的分辨能力，同時還能獲得兩種手段各自單獨使用時所不具備的某些功能。應用于β-受體激動劑殘留分析的主要是氣相色譜-質譜法(GC-MS)、液相色譜-質譜法(LC-MS)以及毛細管電泳-質譜法(CE-MS)。

1)氣相色譜-質譜法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)

GC-MS是β-受體激動劑殘留檢測中使用最多的分析方法，具有很高的特異性，能在多種殘留物同時存在的情況下對某種特定的殘留物進行定性和定量分析。

Solans 等采用GC-MS分析尿樣中β-受體激動劑的殘留情況。樣品經β-葡萄糖醛酸酶芳基硫酸酯酶水解后，用Bond-Elut Certify提取，β-受體激動劑通過 N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)衍生后，再由GC-MS在全掃描(Scan)模式下分析，選擇離子監測(SIM)模式定量。朱堅等到對GC-MS同時測定肝、腎和肉中11種β-受體激動劑殘留的方法進行了研究。樣品經pH5.2的乙酸鈉緩沖溶液提取，提取液用β-鹽酸葡萄糖醛苷酶芳基硫酸酯酶水解，用高氯酸沉淀蛋白質，經異丙醇乙酸乙酯(6+4，v/v)液液分配，再經陽離子交換樹脂(SCX)小柱凈化后，用BSTFA衍生化，以美托洛爾為內標，GC-MS在電子轟擊(El)電離源、SIM模式下檢測。方法回收率為71%～94%，CV為4.6%～18.7%，最低檢測限為0.002～0.0005mg/kg。孟娟等采用類似的技術測定了動物組織中克倫特羅、沙丁胺醇、妥布特羅、特布它林、噴布特羅、心得安、倍他索洛爾、非諾特羅等8種β-受體激動劑的殘留量。GC-MS在EI電離源、SIM模式下檢測，方法回收率范圍為51.9%～101.7%，RSD為2.7%～16.0%。田苗建立了豬肉、豬肝、豬腎中10種β-受體激動劑殘留量的檢測方法。樣品經乙酸鈉緩沖溶液提取后，依次經液液萃取、陽離子交換柱凈化，再經BSTFA-三甲基氯硅烷(TMCS)(99+1，v/v)衍生，GC-MS檢測。該方法線性關系良好，相關系數2大于0.996，檢出限為1～5ug/kg；對豬組織樣品的室內平均回收率為59%～77%，RSD為0.87%～7.0%，室間平均回收率為63%～76%，RSD為1.5%～12.6%。

Amendola等國采用氣相色譜-離子阱質譜(GC-MSn)分析尿樣中克倫特羅的殘留情況。克倫特羅衍生物用EI源電離，通過三級質譜得到了充分的結構信息。MS1為m/z 335～337，MS2為m/z 300，但在四級質譜中沒有發現進一步確證的結構信息，并且沒有提高信噪比。MS3的靈敏度優于0.2ug/L，線性范圍在0.5～5ug/L之間。作者認為，與GC-MS和氣相色譜-串聯質譜(GC-MS/MS)相比，GC-MS3也是β-受體激動劑確證檢測的良好手段。

Batjoens等采用GC-MS對動物糞便中β-受體激動劑的殘留情況進行分析。通過不同的離子化模式(EI、Cl)、不同的衍生化方法以及串聯質譜比較研究，獲得了大量的質譜信息。在El電離方式下，部分β-受體激動劑TMS衍生物的質譜斷裂途徑參見圖1-3。

圖1-3部分 β-受體激動劑TMS衍生物的EI斷裂途徑

2)液相色譜-質譜聯用法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)

HPLC方法由于檢測器選擇性的限制，導致靈敏度相對較低。但隨著電噴霧(ESI)接口技術的成熟，使LC-MS在β-受體激動劑分析領域迅速得到發展。同時，由于串聯質譜技術(MS/MS)的出現，質譜檢測器的選擇性和靈敏度得到了進一步的提升，定性同時進行定量，使得LC-MS在β-受體激動劑檢測領域得到普及，并逐步取代GC-MS成為應用最為廣泛的現代分析技術。

Caloni等采用LC-MS技術對經ELISA試劑盒篩選的代乳制品中陽性結果進行了復核，可以同時確證沙丁胺醇、馬布特羅、克倫特羅和特布它林。馬布特羅、克倫特羅和特布它林的檢測低限為250ng/mL，沙丁胺醇為2.5ug/L，方法回收率為84%～90.2%。

劉暢等建立了動物源性食品中15種β-受體激動劑殘留的LC-MS/MS檢測方法。選用β-鹽酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酯酶水解，PCX柱凈化，以乙腈-甲醇-0.4%甲酸(30+4+66，v/v)作為流動相，LC-MS/MS檢測。采用外標法定量，15種β-受體激動劑的平均回收率為54.0%～98.9%，最低檢出濃度為0.04～0.33ug/kg。Liu等利用LC-MS/MS技術，在ESI正離子、多反應監測(MRM)模式下，建立了豬肝和豬肉中20種β-受體激動劑的測定方法。為減小基質效應的影響，采用基質添加標準曲線定量，CCa為0.05～0.23 ug/kg(豬肉)、0.05～0.57 ug/kg(豬肝)，CCβ為0.11～0.4ug/kg(豬肉)、0.16～0.79ug/kg(豬肝)。孫志文等利用LC-MS/MS測定了豬肌肉組織中苯乙醇胺A的殘留量。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm×50mm，1.7um)，流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液(30+70，v/v)，流速0.3mL/min，在ESI正離子模式下，采用MRM模式檢測。方法檢測限為0.2ug/kg。

王娟等建立了LC-MS/MS同時檢測牛奶中10種β-受體激動劑殘留量的方法。樣品經沉淀蛋白質，酸性水溶液提取，MCX固相萃取柱凈化，LC-MS/MS方法測定。采用Thermo Hypersil Gold(150mm×2.1mm，5um)色譜柱分離，5mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇為流動相，梯度洗脫。方法線性相關系數r均大于0.999；克倫特羅LOD為1.68ug/kg，其余9種β-受體激動劑在0.146～0.203ug/kg之間；克倫特羅LOQ為3.37ug/kg，其余9種在0.290～0.407ug/kg之間；3個添加水平下，10種β-受體激動劑平均回收率在91%～127%之間。聶建榮等]建立動物尿液中15種β-受體激動劑的LC-ESI-MS/MS同時分析方法。樣品用高氯酸溶液酸解及沉淀蛋白質，經HLB固相萃取小柱凈化、富集后，以甲醇和0.1%甲酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫，采用MRM模式進行定性和定量分析。15種β-受體激動劑在0.25～20μg/L的范圍內線性關系良好(r≥0.9995)；在0.25ug/L、1.0ug/L、10μg/L添加水平下，方法回收率為62.1%～107%，RSD為3.5%～9.9%；LOQ為0.25μg/L。

Fan等的應用高效液相色譜-線性離子阱質譜(HPLC-LIT-MS)法建立了同時測定動物源食品中25種β-受體激動劑殘留的分析方法。樣品水解后用5%三氯乙酸提取，然后用MCX柱結合甲醇進行凈化。以甲醇和0.1%甲酸水作為梯度洗脫的流動相，Supelco Ascentis Express RP-酰胺柱進行LC分離后，在ESI+、多重反應監測(CRM)模式下進行測定，將由氟標記的9種β-受體激動劑作內標進行定量。分析物的線性范圍為5～200ug/L，線性相關系數大于或等于0.995；添加回收率在46.6%～118.9%之間，RSD為1.9%～28.2%；方法CCa和CCβ范圍分別為0.05～0.49 μg/kg和0.13～1.64ug/kg。

在LC-ESI-MS分析中，β-受體激動劑的斷裂途徑參見圖1-4。

圖1-4 β 受體激動劑ES1質譜斷裂途徑

3)毛細管電泳-質譜法(capillary electrophoresis-mass spectrometry，CE-MS)毛細管電泳-質譜技術(CE-MS)在β-受體激動劑的分析中應用較少。

Anurukvorakun等采用非水毛細管電泳-質譜(NACE-MS)技術建立了豬肉中痕量β-受體激動劑(克倫特羅、沙丁胺醇、特布特羅等)的測定方法。NACE采用甲醇-乙-冰醋酸(66+33+1，v/v，含18mmol/L乙酸銨)緩沖溶液，電壓28kV，飛行時間質譜(TOF-MS)采用甲醇-水(80+20，v/v含5mmol/L乙酸銨)為鞘液，水動力和電動力聯合進樣，提高了方法靈敏度。該方法對所有分析物的檢測限均為0.3ppb，線性范圍為0.8～1000ppb，相關系數大于0.999，方法回收率為69%～80%，RSD小于17.7%。通過與LC-MS/MS方法進行比較驗證，沒有發現統計學差異。van der Vlis等建立了一種在線液液電萃取-等速電泳-毛細管區帶電泳-電噴霧質譜(EE-ITP-CZE-ESP-MS)方法分析鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、特布它林和非諾特羅。在高電場力作用下，通過液液萃取快速將離子化的β-受體激動劑從低導電率的有機溶劑萃取到一個小體積的緩沖溶液中，而ITP使分析物遠離液-液界面，再經毛細管區帶電泳-電噴霧質譜測定。鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇和特布它林的檢測限可達到2×10-9 mol/L，非諾特羅為5×10-9mol/L。

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