吡唑酮類藥殘留測定——高效液相色譜法

時(shí)間：2023-03-25 00:51:32來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

吡唑酮類藥殘留測定——高效液相色譜法

[db:作者] / 2022-12-20 00:00

(6)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography， HPLC)

本類藥物的吡唑酮結(jié)構(gòu)具有紫外吸收特性，HPLC分析主要采用反相色譜分離，紫外檢測器(ultraviolet detector，UVD)測定。

1)酸性藥物

龐國芳等采用反相HPLC測定了動(dòng)物肌肉中的保泰松。以0.05 mol/L乙酸銨溶液-甲醇-乙腈(53+35+12， v/v) 為流動(dòng)相，流速0.8 mL/min， C18 色譜柱分離，柱溫40℃，檢測波長270 nm。豬肉、牛肉、雞肉、羊肉的回收率在75%～105%之間，RSD在4.0%～10.0%之間，LOD為5 μg/kg。作者對(duì)流動(dòng)相配比進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，減少甲醇比例，雜質(zhì)峰的數(shù)量顯著增加，逐漸出現(xiàn)較大的干擾峰，直至淹沒樣品峰；減少乙腈的比例，靈敏度會(huì)減小，與雜質(zhì)峰的分離度降低，峰形和回收率又逐步降低，但與樣液中的干擾物能完全分開。

Neto等采用HPLC-UVD測定血液中的保泰松和羥布宗。凈化后的樣品采用Chrospher RP-18 色譜柱分離，流動(dòng)相為0.01 mol/L乙酸-甲醇(45+55， v/v)，流速1 mL/min，檢測波長為254 nm。方法回收率為83%～105%， CV為4.7%～7.8%，保泰松的LOD為0.5 μg/ml，羥布宗為1.0 μg/mL。Grippa等建立了同時(shí)測定馬血液中保泰松、羥布宗等4種藥物的HPLC方法。色譜分離選用C18色譜柱，流動(dòng)相采用乙腈-水(含0.1%三氟乙酸和0.1%三乙胺)(51+49， v/v)，流速1 mL/min，檢測波長254 nm。保泰松、羥布宗的回收率分別為51.5%±2.7%和 37.9%±0.9%， CV分別為5.5%～ 14.8%和2.7%～13.6%；保泰松LOD為0.5 μg/mL，羥布宗為1 μg/mL。Marti 等采用乙腈提取血漿中的保泰松，上清液直接進(jìn)HPLC分析。色譜柱采用chrospher 60 RP (150 mm×4.6mm，5um)，流動(dòng)相為0.01mol/L乙酸-甲醇(35+65，v/v)，流速1mL/min，檢測波長240nm。方法回收率為83%，LOD和LOQ分別為0.016ug/mL和0.029μg/mL。Taylor等采用 HPLC測定馬血液中保泰松和羥布宗。色譜柱為Hypersil C18(100mm×4.6mm，5um)，流動(dòng)相為甲醇-0.1%乙酸溶液(6+4，v/v)，流速1.5mL/min，檢測波長240 nm。保泰松和羥布宗的回收率分別為53.5%～63.1%和43.3%～47.2%；CV分別為5.1%和4.0%，LOQ為10μg/mL。De Veau測定牛血漿中游離的保泰松，血漿經(jīng)過分子濾過膜濾去分子量大于10000的雜質(zhì)后，離心取上清，進(jìn)HPLC測定。色譜柱為反相C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為0.2mol/L磷酸鈉緩沖液-甲醇(1+1，v/v)，流速1mL/min，檢測波長264nm。方法回收率為91%～93%，CV為1%～4%，LOQ為2 μg/mL。Caturla等將血液提取液蒸干后，用甲醇復(fù)溶，反相色譜C18(250mm×4.6mm，5μm)分離，流動(dòng)相采用pH3的0.02mol/L硫酸銨-乙腈(45+55，v/v)，流速為1mL/min，檢測波長240nm。保泰松和羥布宗的LOQ均為0.05μg/mL，回收率大于90%。Marunaka等測定血液和尿液中的保泰松、羥布宗，樣品用鹽酸酸化后，萃取至苯-環(huán)已烷(1+1，v/v)溶液，萃取液吹干后復(fù)溶于甲醇，進(jìn)HPLC測定。色譜柱為C8(30cm×4mm，10μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.01mol/L乙酸銨，梯度洗脫，流速2.0mL/min，檢測波長254nm。保泰松、羥布宗和y-羥基保泰松的LOD均為0.05μg/mL，保泰松、羥布宗的回收率分別為96.7%±1.7%和93.1%±3.7%。

Haque等將血漿直接注入HPLC系統(tǒng)測定保泰松和羥布宗。采用半通透表面色譜柱5PM-S5-100-C18 (15 cm×4.6 mm)分離，流動(dòng)相為乙腈磷酸鹽緩沖液(15+85，v/v)，流速1 mL/min，檢測波長270nm。該方法線性范圍為0.5～20ug/mL，CV小于6%，保泰松和羥布宗的LOQ和LOD分別為0.5ug/mL和0.25μg/mL，分析時(shí)間小于13min。半通透性表面色譜柱可多次進(jìn)血清樣品，色譜柱含有兩種作用機(jī)制的固定相，外層為多孔水溶性的聚氧乙烯共價(jià)結(jié)合在硅膠基質(zhì)上，內(nèi)層為脂溶性C18、C8、氰基和苯基。半通透性表面色譜柱流動(dòng)相中有機(jī)溶劑含量應(yīng)低于25%，pH為5.5～7.5，溶液中鹽分含量應(yīng)在0.05～0.1mol/L之間，以防樣品中蛋白質(zhì)沉淀。該方法非常簡單，血清樣品可直接進(jìn)HPLC測定。

2)堿性藥物

Katz等建立了測定血漿中安乃近4種代謝物的HPLC方法。樣品用氫氧化鈉溶液堿化后，用二氯甲烷提取，提取液蒸干，流動(dòng)相復(fù)溶，HPLC測定。色譜柱為PBondapak C18 柱(300mm×3.9mm)，流動(dòng)相為甲醇-0.01mol/L乙酸鈉溶液(用鹽酸調(diào)節(jié)pH3.0)(8+92，v/v)，流速1.6mL/min，檢測波長257nm，用異丙基氨基安替比林為內(nèi)標(biāo)定量。FAA和AAA的校正回收率為96.0%～100%，MAA和AA為70.6%～87.8%，CV均低于6.7%；LOD均為0.1μg/mL。王章陽等建立了同時(shí)測定兔血漿中安乃近及其3種代謝物(FAA、AA和MAA)的HPLC方法。以2-萘-磺酸鈉為內(nèi)標(biāo)，pH6.5的。甲醇-水-磷酸鹽緩沖液(35+63+2，v/v)為流動(dòng)相，采用ODS(15mm×6mm)分析柱分離，流速1.0mL/min，柱溫35℃，檢測波長260nm。FAA、AA和MAA平均回收率均接近100%，LOD均為0.15μg/mL。崔景斌等用HPLC測定血漿中的安乃近代謝物MAA。內(nèi)標(biāo)物為異丙氨基安替比林，色譜柱為YWG-C18柱(150mm×5mm)，流動(dòng)相為pH5.5磷酸鹽緩沖液-甲醇(68+32，v/v)，流速2mL/min，檢測波長254nm。MAA的絕對(duì)回收率為82.5%，相對(duì)回收率為99%，CV小于3.66%，檢測LOQ為0.05μg/mL。

沈金燦等建立了牛和豬肌肉中安乃近代謝物FAA、AA和MAA的HPLC測定方法。采用Inertsil ODS3色譜柱分離，水和甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1mL/min，檢測波長265nm。FAA的回收率為81.3%～92.5%，AA的回收率為82.0%～96.0%，MAA的回收率為80.4%～90.6%；RSD均在7%以內(nèi)；LOQ均為50.0μg/kg。研究發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相pH低于7.0時(shí)，隨著pH的降低，各組分在反相色譜柱上的保留降低。雖然各組分分離度并沒有明顯的降低，但由于保留時(shí)間的縮短容易引起目標(biāo)組分與干擾組分共洗脫，從而影響目標(biāo)物的測定。同時(shí)，在相同的梯度條件下，用甲醇時(shí)的保留時(shí)間比用乙腈的保留時(shí)間長，這使得FAA能夠與干擾組分實(shí)現(xiàn)良好的分離。另外，在中性條件下，不同的水相流動(dòng)相(20mmol/L醋酸銨溶液、20mmo/L磷酸鹽溶液和純水)對(duì)目標(biāo)物的分離沒有顯著的影響，但采用緩沖液體系進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，基線會(huì)隨著含水量的變化產(chǎn)生較大的波動(dòng)。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T20747-200651也采用InertsilODS3色譜柱分離，以水-甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1mL/min，265nm波長處測定FAA、MAA和AA。方法LOD在12.5～20ug/kg之間，定量范圍為50～400ug/kg，回收率為80%～96%。

MikatimA等建立了測定尿液中安替比林及其代謝物的HPLC方法。尿液酶解后，用乙酸乙酯提取，提取液蒸干后用流動(dòng)相復(fù)溶，進(jìn)HPLC測定。色譜柱為反相C18柱(30cm×3.9mm)，流動(dòng)相為含7.5%乙腈的0.1mol/L乙酸鈉溶液(用乙酸調(diào)節(jié)pH6.6)，流速3.5mL/min，柱溫35℃，檢測波長254nm。安替比林、NORA、OHA、HMA的回收率在97%～105%之間，CV小于5%，LOQ低于3μg/mL。

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