氯霉素類藥殘留測(cè)定——免疫分析法（三）

時(shí)間：2023-03-25 07:17:15來(lái)源：food欄目：食品快速檢測(cè) 閱讀：

氯霉素類藥殘留測(cè)定——免疫分析法（三）

[db:作者] / 2022-12-09 00:00

4)免疫傳感器(immunesensor，IS)

免疫傳感器就是利用抗原(抗體)對(duì)抗體(抗原)的識(shí)別功能而研制成的生物傳感器。作為一種新興的生物傳感器中，免疫傳感器以其鑒定物質(zhì)的高度特異性、敏感性和穩(wěn)定受到青睞，它的問(wèn)世使傳統(tǒng)的免疫分析發(fā)生了很大的變化。免疫傳感器主要包括表面等離子體共振(SPR)和電化學(xué)免疫傳感器(ECIS)等。

A.表面等離子體共振(surface plasmon resonance， SPR)

Ferguson等采用涂有CAP衍生物和抗體的傳感器芯片，開(kāi)發(fā)了快速檢測(cè)禽肉、蜂蜜、蝦、牛奶中CAP和葡糖苷酸CAP殘留的SPR分析方法。該抗體對(duì)葡糖苷酸CAP的交叉反應(yīng)率為：73.8%(禽肉)、69.2%(蜂蜜)、75.7%(蝦)、84.8%(奶)，與其他化合物沒(méi)有交叉反應(yīng)。脂肪含量小于3.5%的牛奶可以直接檢測(cè)，禽肉、蜂蜜、蝦需要用乙酸乙酯提取后再用傳感器測(cè)定。方法CCa為：0.005μg/kg(禽肉)、0.02ug/kg(蜂蜜)、0.04ug/kg(蝦)、0.04ugkg(奶)，CCβ分別為：0.02ug/kg、0.02ug/kg、0.07ug/kg、0.05ug/kg。Ashwin等采用SPR傳感器篩選檢測(cè)蜂蜜、蝦及動(dòng)物內(nèi)臟中的CAP和葡糖苷酸CAP。樣品中分析物經(jīng)酶解，溶劑提取，并用SPE凈化后，用SPR測(cè)定。方法CCa為0.1ug/kg，CCβ為0.2ug/kg。Fermandez等開(kāi)發(fā)了一種基于黃金衍射光柵表面等離子體的新型便攜式六通道SPR傳感器，用于牛奶樣品中CAP的檢測(cè)。用兩種類型含聚乙二醇(PEG)的巰基烷基試劑制備形成混合自組裝單分子層(m-SAM)，將芯片與半抗原蛋白共價(jià)結(jié)合，使生物功能化。將樣品或標(biāo)準(zhǔn)品與特異性多克隆抗體混合，并注入傳感器裝置。緩沖液中CAP的LOD為0.26μg/L。牛奶樣品只需5倍稀釋后即可進(jìn)行檢測(cè)，而無(wú)須其他凈化步驟。

B.電化學(xué)免疫傳感器(electrochemicalimmunosensor， ECIS)

宋巍巍等以O(shè)VA-CAP偶聯(lián)物為包被抗原，并將其包被到聚苯乙烯反應(yīng)板上。在孵育反應(yīng)中，樣品中的CAP與OVA-CAP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CAP單克隆抗體，洗滌后加入堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的二抗，經(jīng)再次孵育及洗滌后加入對(duì)硝基苯磷酸(pNPP)底物液。反應(yīng)終止后用線性導(dǎo)數(shù)伏安法記錄pNPP水解產(chǎn)物的氧化峰電流。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用免疫傳感法檢測(cè)CAP的靈敏度高于傳統(tǒng)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。該方法檢測(cè)CAP的LOD為0.064ug/L，檢測(cè)線性范圍為0.15～600ug/L，測(cè)試牛奶樣品的平均回收率為89.8%。另外，由于電化學(xué)免疫傳感器體積較小，便于攜帶，操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)牛乳樣品中CAP殘留的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。謝東華等研制了基于CAP抗體包被Fe3O4/Au金磁納米微粒(GMP)和三乙撐四胺銅(II)(CuL)共固定修飾平面熱解石墨電極的安培免疫傳感器，用于測(cè)定魚肉中CAP含量。該免疫傳感器利用外加磁場(chǎng)，將抗CAP-GMP吸引到CuL修飾的PRG電極表面制備而成。CuL對(duì)H2O2還原具有良好的電催化能力，當(dāng)該傳感器在含CAP樣品液中溫育后，CAP與電極表面的抗CAP的免疫結(jié)合物導(dǎo)致CuL對(duì)H2O2的催化還原電流(I)降低，電流下降值和CAP濃度成正比，可用于CAP定量測(cè)定。在25℃的pH6.5磷酸鹽緩沖液中溫育30min，該傳感器對(duì)CAP的檢測(cè)線性范圍為0.6～110ng/mL，LOD為0.092ng/mL，添加回收率在97%～104%之間。Kim等制備了CAP的安培免疫傳感器。在被黏結(jié)到導(dǎo)電高分子(聚TTCA)層的改性樹(shù)枝狀硫化鎘納米粒子(CdS)上共價(jià)固定抗CAP乙酰轉(zhuǎn)移酶(抗-CAT)抗體。為了提高傳感器探頭的靈敏度，金納米粒子、樹(shù)枝狀聚合物和CdS納米顆粒被沉積到聚合物層。用掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)測(cè)定粒徑。樹(shù)枝狀聚合物、CdS和抗-CAT的固定用能量破壞性分析法(EDS)、X射線光電子能譜法(XPS)和石英晶體微天平(QCM)技術(shù)證實(shí)。基于游離和標(biāo)記-CAP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗-CAT的活性位點(diǎn)的免疫反應(yīng)，來(lái)檢測(cè)CAP含量。肼用于CAP標(biāo)記，在-0.35V，可電化學(xué)催化H2O2的減少。優(yōu)化條件下，該傳感器在50～950pg/mL濃度范圍呈良好線性，LOD為45pg/mL，并用于肉樣中CAP的測(cè)定。

C.其他

Que等基于金納米粒子(AuNP)催化4-硝基苯酚(4-NP)還原反應(yīng)，開(kāi)發(fā)了一種新的競(jìng)爭(zhēng)型免疫傳感系統(tǒng)，采用紫外-可見(jiàn)光(UV-vis)分光光度計(jì)檢測(cè)蜂蜜和牛奶中的CAP。直徑為16nm的AuNP用CAP-BSA結(jié)合物合成和官能化，被用作包被在聚苯乙烯微量滴定板(MTP)上的抗-CAP單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)物。在目標(biāo)CAP存在的情況下，AuNP上標(biāo)記的CAP-BSA，與目標(biāo)CAP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合MTP上固定的抗體。MTP上CAP-BSA-AuNP結(jié)合物隨著樣品中目標(biāo)CAP的增多而減少。當(dāng)向MTP加入4-NP和NaBH4，攜帶的AuNP將4-NP催化還原為4-氨基苯酚(4-AP)，而4-AP可以用UV-vis分光光度計(jì)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)表明,在403nm的吸光度值會(huì)隨著樣品中CAP濃度的增加而增大。方法在0.1～100ng/mL范圍內(nèi)，呈良好線性；LOD可達(dá)到0.03ng/mL；批內(nèi)、批間CV分別小于5.5%和8.0%；回收率在92%～112%之間。

Gaudin等基于CAP溶液對(duì)抗CAP多克隆抗體與傳感器上固定的CAP的結(jié)合的抑制，開(kāi)發(fā)了一種免疫生物傳感器。響應(yīng)值與樣品中CAP的濃度成反比。該研究對(duì)兩種不同的抗體和兩個(gè)固定CAP的方法進(jìn)行了比較，通過(guò)ELISA測(cè)試發(fā)現(xiàn)抗體質(zhì)量對(duì)分析的影響很大，而且固定CAP的方法是關(guān)鍵點(diǎn)。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，該傳感器可檢測(cè)CAP及其葡萄糖醛酸結(jié)合物，LOD可達(dá)到0.1μg/L，整個(gè)分析時(shí)間不超過(guò)3min，并可用于膽汁、尿液和肉中CAP的測(cè)定。

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