β-受體激動劑殘留測定方法（二）

時間：2023-03-25 08:18:26來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

β-受體激動劑殘留測定方法（二）

[db:作者] / 2022-12-08 00:00

(4)生物傳感器技術(shù)(biosensor)

其原理為待測物與分子識別元件特異性結(jié)合后，所產(chǎn)生的復(fù)合物(或光、熱等)通過信號轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢暂敵龅碾娦盘枴⒐庑盘柕龋瑥亩_到分析檢測的目的。利用生物傳感器可檢測動物尿液、血清中β-受體激動劑的含量。肖紅玉等利用抗原抗體專一性結(jié)合而導(dǎo)致電化學(xué)變化的原理設(shè)計成了免疫生物傳感器，克倫特羅的檢出限為0.1ug/L，線性范圍為0.1～8.1ug/L，檢測時間在20min以內(nèi)。通過對100個已知陽性樣品和100個已知陰性樣品的測試，準確率為97%

Chen等研制了以F0F1-ATP酶為動力蛋白的生物傳感器，測定食品中的克倫特羅。標記F1300的內(nèi)色素細胞熒光探針被用作檢測由F0F1-ATP酶合成的ATP驅(qū)動的質(zhì)子通量的pH指示劑。此外，F(xiàn)0F1 ATP酶的Flβ亞基附著在“抗抗體-生物素-抗生物素蛋白-生物素-第二抗體(特異性針對克倫特羅)”系統(tǒng)，作為生物傳感器來檢測克倫特羅殘留。捕獲機理是抗原-抗體反應(yīng)，而檢測基于旋轉(zhuǎn)催化ATP合成過程中pH變化引起的熒光變化。結(jié)果表明，F(xiàn)0F1-ATP酶的活性受不同負載的影響，這種新的生物傳感器可用于超痕量(10-12 g/L)克倫特羅的檢測。該類方法具有靈敏度高、特異性強、樣品前處理簡單、檢測迅速、攜帶方便、能重復(fù)利用并能實現(xiàn)現(xiàn)場檢測和在線檢測等優(yōu)點。

(5)流動注射化學(xué)發(fā)光技術(shù)(flow injection-chemiluminescence，F(xiàn)I-CL)

Fl-CL的原理是基于把一定體積的液體試樣注射到一個運動著的、無空氣間隔的由適當液體組成的連續(xù)載流中。被注入的試樣在向前運動過程中由于對流和擴散作用而分散成一個個具有濃度梯度的試樣帶，試樣帶與載流中某些組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生某種可以被檢測的物質(zhì)，然后被載帶到檢測器中連續(xù)記錄其吸光度、電極電位或其他物理參數(shù)。試樣流過檢測器的流通池時，這些參數(shù)連續(xù)地發(fā)生變化。典型的檢測儀輸出信號呈峰形，其高度或面積與待測物濃度有關(guān)。陳麗莉等設(shè)計了一種快速檢測豬肉中鹽酸克倫特羅的Fl-CL免疫分析方法。由辣根過氧化物酶(HRP)催化的魯米和過氧化氫-尿素加合物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可通過4-聯(lián)苯硼酸得到增強。在競爭性免疫反應(yīng)后，上清酶標復(fù)合物由FI-CL法進行檢測。在優(yōu)化條件下，測定克倫特羅的線性范圍為0.05～9ug/L(r=0.9959)，檢出限為0.02μg/L。該方法已經(jīng)成功應(yīng)用于豬肉中克倫特羅殘留的檢測。

(6)色譜技術(shù)(chromatography)

色譜作為一種高效分離分析技術(shù)，是目前β-受體激動劑殘留分析中應(yīng)用最廣的分析手段，主要包括氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細管電泳法(CE)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)等。

1)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC是近年來發(fā)展較快的β-受體激動劑殘留分析技術(shù)之一。采用高壓泵、高效固定相和高靈敏度的檢測器，具有重現(xiàn)性好、分離效率高等優(yōu)點。結(jié)合紫外檢測器(UVD)、二極管陣列檢測器(DAD)、熒光檢測器(FLD)、電化學(xué)檢測器(ECD)等，對β-受體激動劑的檢測限可以達到ug/kg級別。

Miyazaki等采用HPLC-UVD檢測動物組織中克倫特羅，采用ODS柱分離，0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH3.5)-乙腈(7+3，v/v)為流動相，流速0.9mL/min，在209nm或242nm檢測，測定低限為5ng/g，回收率為75.1%～86.4%。Tsai等采用HPLC-DAD檢測豬血漿和組織中的克倫特羅和沙丁胺醇殘留。Nova-pak C18色譜柱分離，沙丁胺醇流動相為乙腈-水(15+85，v/v)，克倫特羅流動相為乙腈-水(30+70，v/v)，流速1.0mL/min，檢測波長210nm(克倫特羅)和196nm(沙丁胺醇)。克倫特羅和沙丁胺醇的檢測低限分別為0.2uL/L和0.1uL/L；血漿中沙丁胺醇的平均回收率為86.7%，克倫特羅為80.0%；肌肉中沙丁胺醇的平均回收率為64.2%，克倫特羅為62.9%。

Hashimoto等采用HPLC-FLD檢測肉中的沙丁胺醇。在ODS柱(TSKgel-ODS80Ts)上分離，流動相為0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH3.0)-乙腈(92+8，v/v)，激發(fā)波長為225nm，發(fā)射波長為310nm。方法測定低限為5ng/g，在100ppb添加水平的回收率為77.6%～81.5%。

安洪澤等采用反相HPLC-UVD-FLD法測定豬飼料中克倫特羅、沙丁胺醇、非諾特羅、萊克多巴胺和班布特羅。在C18色譜柱上，以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，流速1mL/min，UVD檢測波長249nm(克倫特羅)，F(xiàn)LD激發(fā)波長226nm、發(fā)射波長306nm(沙丁胺醇、非諾特羅、萊克多巴胺和班布特羅)進行串聯(lián)檢測。方法檢測限(LOD)為20ug/kg，LOQ為50ug/kg，平均回收率范圍為86.7%～103.5%，CV范圍為1.5%～9.5%。

一些β-受體激動劑具有電化學(xué)活性，可在電極上發(fā)生氧化反應(yīng)，可采用ECD檢測，來提高靈敏度。Turberg等采用HPLC-ECD檢測了豬血清和猴血漿中萊克多巴胺殘留。HPLC采用等度洗脫，電壓為+700mV，運行時間6.5min。方法線性范圍為0.5～40ng/mL，LOQ為2ng/mL。Zhang等采用HPLC-庫侖電極檢測系統(tǒng)對豬肝中的克倫特羅殘留情況進行分析。四個電極串聯(lián)使用，電位分別為450mV、600mV、650mV和680mV，從而避免了其他ECD檢測中β-受體激動劑能在高電位作用下被不可逆的氧化的缺點，提高了HPLC的選擇性和精密度。同時，研究了流動相pH對保留時間和峰高的影響和克倫特羅在石墨電極上的電化學(xué)行為。該方法線性良好，檢測限為1.2ng/g。

2)氣相色譜法(gas chromatography，GC)

GC與電子捕獲檢測器(ECD)、氮磷檢測器(NPD)、氫火焰離子化檢測器(FID)等結(jié)合，檢測β-受體激動劑具有檢測精密度高、分離度好，能分離其同位素、同分異構(gòu)體、對映體等優(yōu)點，但也具有樣品需要衍生化，不能定性等缺點。

用GC測定β-受體激動劑通常需要衍生化來提高檢測靈敏度，最常用的衍生化技術(shù)是硅烷化技術(shù)，常用的衍生化試劑是雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)。盡管有用環(huán)狀二甲基硅烷嗎啉(DMS)、甲基硼酸(MBA)等作為衍生化試劑的報道，由于其使用有一定的局限(如對特布它林無法生成衍生物)，而限制了使用范圍。采用BSTFA進行衍生化反應(yīng)如圖1-2。

圖1-2 β-受體激動劑與BSTFA的衍生化反應(yīng)

崔曉明等建立了GC分析動物組織中鹽酸克倫特羅殘留量的方法。采用固相萃取分離富集動物組織中的鹽酸克倫特羅，經(jīng)BSTFA衍生化后用GC-ECD檢測，以外標法多點校準定量。測得動物組織中克倫特羅的峰面積與樣品濃度在0.005～1.0ug/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999，肉樣的加標回收率在70%～80%，最低檢出限為1ug/kg。謝維平等采用厚膜非極性柱對未經(jīng)衍生化的克倫特羅直接分離，用NPD檢測，分離峰形良好，平均回收率為86.0%，RSD為5.0%，相關(guān)系數(shù)為0.9993，線性范圍為0.1～40.0mg/L，檢測限為0.03mg/L。黃盈煜等提取內(nèi)臟組織中的克倫特羅后，用乙酸酐衍生化，再采用GC-NPD檢測。該方法線性范圍為5～250ug/kg，最小檢測濃度為0.011ug/mL。Engelmann等采用固相微萃取(SPME)提取凈化樣品中的克倫特羅，在進樣口硅烷化衍生后，用GC-FID測定其六甲基二硅衍生物，檢測靈敏度可以達到1.1ppb。

3)毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE)

CE具有分離效率高、分析速度快、重現(xiàn)性好、樣品和試劑用量少等優(yōu)點，同時具有很大的操作靈活性，許多分離參數(shù)如緩沖液的組成、pH、毛細管的類型、所用電場的波形等都可以調(diào)節(jié)，分離效率可達幾百萬理論塔板數(shù)，被視為高效的分離技術(shù)之一。Gausepohl等利用CE-UVD來檢測尿樣中克倫特羅對映體的殘留情況。樣品用己烷-叔丁基甲基醚(99.5+0.5，v/v)提取后，電動注射進樣(50s，10kV)，磷酸鹽緩沖液(pH3.3)和羥乙基-β-環(huán)糊精作為手性選擇劑。整個分析時間小于15min，以S-(-)-布拉洛爾為內(nèi)標，克倫特羅對映體的檢測限為0.5ng/mL。管月清等采用CE-ECD法測定了肉制品中克倫特羅和沙丁胺醇的含量。考察了緩沖液酸度和濃度、分離電壓、氧化電位和進樣時間等實驗參數(shù)對分離檢測的影響，在最佳實驗條件下，工作電極為直徑300um的碳圓盤電極，檢測電位為+950mV(vs.SCE)，緩沖液為40mmol/L硼砂溶液(pH7.4)，分離電壓18kV，在8min內(nèi)即可實現(xiàn)二者的分離，且在兩個數(shù)量級的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，LOD分別為1.11×107mol/L和9.80×103mol/L，且抗壞血酸對其檢測不產(chǎn)生干擾。

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