阿維菌素類藥物殘留分析技術——凈化方法

時間：2023-03-24 21:04:41來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

阿維菌素類藥物殘留分析技術——凈化方法

[db:作者] / 2022-12-26 00:00

(2)凈化方法

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

LLP法通過AVMs在不相溶的兩相中的溶解度的不同而達到凈化目的，但LLP操作麻煩，且凈化效果不佳，采用越來越少，常作為其他凈化方法的輔助手段。徐英江等研究了水產品中IVM、AVM、EPR、DPR的LLP-HPLC分析方法。樣品用異辛烷進行提取，蒸干后用正己烷溶解，再用乙腈進行反萃取凈化，用N-甲基咪唑和三氟乙酸酐進行衍生后，HPLC檢測。所有藥物的LOD均能達到1.0μg/kg；在添加濃度1～50μg/kg范圍，平均回收率為78.9%～106%，RSD為5.8%～11.2%。在測定動物組織時，較其他基質的食品，凈化的要求更高，有時需要采用異辛烷或正己烷進行LLP除脂。

2)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

SPE是目前應用最為廣泛的AVMs殘留分析凈化技術，C8、C18、HLB、硅膠、氧化鋁等SPE柱均有用于AVMs殘留分析的報道。

A. HLB柱

盧志曉等建立了凍蝦中AVM、IVM、DOR、EPR的殘留檢測方法。試樣經乙腈提取、濃縮，用HLB固相萃取小柱凈化，UPLC-MS/MS測定。4種分析物在2μg/kg、10ug/kg、20μg/kg加標水平的平均回收率為75.1%～92.5%，RSD為6.78%～9.89%；4種藥物的LOD均可達到0.5μg/kg。

B. C8柱

Cerkvenik-Flajs等報道了奶中IVM、AVM、DOR、MOX、EPR及代謝物甲氨基阿維菌素和基奈馬克丁的殘留檢測方法。樣品用乙腈提取，過C8固相萃取柱凈化，衍生化后用HPLC測定。方法回收率在78%～98%之間，室內CV為4.6%～13.4%，室間CV為6.6%～14.5%；EPR的方法檢測限(CCa)為24.8ug/kg，MOX為50.6ug/kg，其他藥物在0.1～0.2μg/kg之間。

C. C18柱

賈方等用乙腈提取牛筋中的AVM和IVM，再用C18固相萃取柱凈化，凈化液經衍生化后，用HPLC分析。AVM和IVM的LOD分別為2.5～4.0ng/g；在3個加標濃度水平下，AVM和IVM的回收率在81.6%～101.0%和101.5%～102.4%之間，RSD均不大于2.0%。Kolberg等用乙腈提取牛奶中的AVM和IVM，提取液過C18固相萃取柱凈化，經銜生后用HPLC測定。AVM的LOD和LOQ分別為0.10ug/L、0.18μg/L，IVM分別為0.14μg/L、0.36μg/L；方法回收率在75%～101%之間，RSD小于10%。石艷麗等用乙腈作為血漿中蛋白質的沉淀劑和DOR的提取劑，離心后上清液旋轉蒸干，C18固相萃取柱凈化后，HPLC測定。方法LOD為0.1ng/mL；樣品的回收率為89.5%～95.67%，不同濃度水平的日內CV和日間CV分別小于4%和5%。汪芳等用乙腈提取犬血漿中SEL后，過C18固相萃取柱進行凈化，HPLC檢測。方法的LOD為0.25ng/mL，CV為1.47%～3.31%，樣品平均回收率為94.0%。程林麗等用乙腈提取牛奶中殘留的AVM、IVM、DOR和EPR，加水和微量三乙胺稀釋，C18固相萃取柱凈化，氮氣吹干并衍生化后，用HPLC測定。在2～1000μg/kg添加范圍，各藥物的回收率為70.2%～110.4%，批內CV為3.9%～8.2%，批間為5.1%～8.2%；EPR、AVM、DOR和IVM的LOD依次為0.5ug/kg、0.5ug/kg、0.4μg/kg和0.2ug/kg，LOQ依次為1.8μg/kg、1.6μg/kg、1.3μg/kg和0.8μg/kg。Xia等以乙腈-水為提取劑，采用PLE提取牛組織中的4種AVMs，提取液經C18固相萃取凈化和衍生后，HPLC檢測。該方法回收率為84.8%～101.8%，RSD小于10.8%；LOD和LOQ分別為0.1～0.2μg/kg和0.5～0.6μg/kg。

D.堿性氧化鋁柱

王亮用乙腈提取牛肉中IVM，提取液過堿性氧化鋁柱，再用乙腈洗脫，蒸干衍生后，HPLC測定。方法LOD為0.05μg/mL，在1～100μg/mL范圍內，回收率在75.9%～96.3%之間。鄭衛東等用乙腈提取豬肝臟中AVM和IVM，過堿性氧化鋁柱凈化后，采用LC-MS/MS檢測。該方法LOD均為2.0ug/kg，LOQ為5.0μg/L；在添加水平2～20μg/kg范圍，AVM和IVM的平均回收率分別為77.0%～83.3%和76.9%～79.8%，RSD分別小于12.1%和13.0%。楊君宏等用乙腈提取牛肌肉組織中的AVM、IVM和EPR，過堿性氧化鋁柱，收集乙腈洗脫液，吹干并復溶后，ELISA試劑盒測定。空白牛肌肉組織中以5ng/g、10ng/g和20ng/g濃度添加時，AVMs回收率為70.9%～108.6%，CV為3.7%～17.1%。

E.中性氧化鋁柱

張睿等用乙腈提取動物源食品中的AVM、IVM、DOR、MOX，提取液過中性氧化鋁固相萃取小柱凈化，經衍生后，再用HPLC進行檢測。方法LOD達到0.001mg/kg，回收率在92%～101%之間。

F.硅膠柱

Massarollo等采用甲醇-乙酸乙酯-正己烷提取蜂蜜中AVM，提取液過硅膠固相萃取柱凈化后，HPLC測定。方法回收率為73.4%～97.45%，RSD在0.91%～13.7%之間；LOD和LOQ分別為0.002mg/kg和0.007mg/kg。

G.復合柱

張文娟等采用乙腈提取10種食品基質中AVM、IVM、DOR、EPR、MOX和SEL的殘留，經PEP-C18混合固相萃取凈化后，UPLC-MS/MS測定。3個添加水平下，6種藥物的回收率在60%～99%之間，RSD為0.2%～8.9%；6種藥物的LOQ均達5.0μg/kg。Wang等采用乙腈提取動物源基質中的AVM、IVM、DOR和EPR，提取液過C18和中性氧化鋁串聯固相萃取小柱凈化后，用UPLC-MS/MS測定。4種AVMs的LOD和LOQ分別為0.05～0.68μg/kg和0.17～2.27μg/kg；方法回收率在62.4%～104.5%之間。

3)免疫親和色譜(immunoffinity chromatography，IAC)

IAC是基于免疫反應的基本原理，利用色譜的差速遷移理論，實現分離和分析。首先，將特異性抗體固定在擔體上，制成免疫親和擔體，然后填柱。分析時，樣品中的待測化合物與吸附劑上的抗體發生抗原-抗體結合反應而被保留在柱上，其他成分被洗脫。隨后，通過洗脫溶劑將待測化合物洗脫下來，洗脫液可進行后續分析。抗體制備、擔體材料選擇、抗體的固定化方式為IAC的關鍵技術。目前，該方法在殘留分析中得到應用。

Li等采取AVM的特異抗體制備了IAC凈化柱，用于牛血漿、牛肌肉中AVM的凈化處理。經HPLC測定，在6μg/kg、60μg/kg添加水平下，回收率為80%～86%，RSD在5%～14%之間，方法LOD為2μg/kg。Li等叫又利用IVM的多克隆抗體與Sepharose CL-4B偶聯，制備IAC柱，對豬肝樣品進行凈化。甲醇提取液過IAC柱凈化后，HPLC檢測，IVM的LOD為2ug/kg，5～10μg/kg添加水平下，回收率為85%～102%，CV為6%～12%。

Wu等利用AVM的多克隆抗體制備了IAC柱，用于凈化豬肝中AVM和IVM后，LC-MS檢測。在5～100μg/kg添加水平，AVM和IVM的回收率分別為74%～94%和65%～87%，LOD為5ug/kg。He等將AVM的多克隆抗體與Sepharose CL-4B偶聯，制備IAC柱，用于牛肝中AVM、IVM、DOR和EPR的殘留檢測。針對該4種AVMs，此IAC柱的動態柱容量分別為3531ng/mL gel、3542ng/mL gel、3543ng/mL gel、3284ng/mL gel凈化液經衍生后用HPLC測定，方法回收率為79.3%～11.9%，CV為1.1%～19.4%，LOQ為2ng/g。Hou等也利用AVM的多克隆抗體與Sepharose CL-4B偶聯，制備了IAC柱，用于牛肉和牛肝中AVM、IVM、DOR和EPR的分析。洗脫液經LC-MS/MS測定，方法LOD為2.5ng/g，LOQ為5ng/g，在添加濃度5～50ng/g，方法回收率為62.93%～84.03%，RSD在6.02%～17.39%之間。楊君宏等用甲醇提取牛肌肉組織中的AVM、IVM、DOR和EPR，經IAC柱凈化，衍生后，用HPLC測定。在5ng/g、10ng/g、50ng/g、100ng/g添加水平下，4種藥物的回收率為77.3%～119.5%，CV為1.5%～18.9%，方法LOD為0.8ng/g。

4)基質固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)

MSPD是一種基于SPE的樣品前處理技術，可直接處理固體、半固體和黏性液體樣品，提取、凈化一步完成。其原理是將固相萃取吸附劑與樣品一起研磨，得到半干狀態的混合物并將其作為填料裝柱，然后用不同的溶劑淋洗柱子，將各種待測物洗脫下來。它的獨特之處在于樣品分離分散在固體表面鍵合的機相中，成為整個層析系統的一部分，提供樣品分離新空間，可以避免樣品均化、沉淀、離心、轉溶、乳化、濃縮等造成的被測物的損失，節約了分析時間，減少了溶劑用量，操作簡單，分析結果相同或優于傳統方法。Garcia-Mayor等開發了基于MSPD凈化技術，檢測羊奶中包括IVM在內7種大環內酯類藥物的殘留分析方法。將樣品與吸附劑混勻裝柱，通過篩選吸附劑材料和洗脫條件，試驗發現以海砂為分散吸附劑，正己烷洗脫除脂，甲醇-乙酸乙酯(1+1，v/v)洗脫可以獲得理想的凈化效果和良好的回收率。凈化液用HPLC測定，在96.5μg/kg和482.6μg/kg添加濃度，方法回收率為74%和97%，RSD為1.6%～9.0%。

5)分散固相萃取(dispersive solid phase extraction，DSPE)

DSPE是一種新的樣品前處理技術，該技術的核心在于選擇對不同種類的藥物都具有良好溶解性能的乙腈作為提取劑，凈化吸附劑直接分散于待凈化的提取液中，吸附基質中的干擾成分，具有操作簡便，處理快速等優點，在多殘留分析中大量應用。與SPE相比，DSPE更加簡便和快速，以此發展起來的QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Rugged，Safe)技術也已在殘留分析中廣泛采用。Rafidah等開發了采用DSPE技術凈化魚肉中AVM、IVM、DOR、MOX和甲氨基阿維菌素的殘留分析方法。勻漿后的樣品加入無水硫酸鎂和氯化鈉，再用乙腈振蕩提取，上清液進行DSPE凈化。加入氧化鋁、PSA和C18吸附劑，充分振蕩，去除基質干擾，再離心，蒸干上清液后，LC-MS/MS測定。在添加濃度5μg/kg，對吸附劑的凈化效果、準確度和精密度進行考察，發現聯合使用PSA和C18對于魚肉的凈化效果最佳。驗證實驗表明，該方法LOD為0.3～0.4ug/kg，LOQ為1ug/kg；線性范圍為1～15ug/kg；回收率在91.9%～102.5%之間，RSD小于19%。

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